Практичне заняття №7. Серологічні методи дослідження.

Загальні відомості

Серологічні методи дослідження ґрунтуються на специфічній взаємодії антигену з антитілом. Вони використовуються для:

• ідентифікації мікроорганізмів;

• серологічної діагностики інфекційних захворювань;

• визначення титру антитіл у сироватці крові.

Одним з основних серологічних методів є реакція аглютинації (РА).

Аглютинація (від лат. agglutinatio — приклеювання) — склеювання і випадання в осад клітин (у мікробіології — бактеріальних клітин) після їх взаємодії зі специфічними антитілами. Результатом реакції є утворення пластівців (аглютинату).

Проведення орієнтовної реакції аглютинації на склі. Облік та оцінка її результатів

Мета: серологічна ідентифікація культури бактерій (завершальний етап ідентифікації після вивчення культуральних, морфологічних, тинкторіальних і ферментативних властивостей).

Інгредієнти:

• специфічна аглютинуюча адсорбована сироватка (відоме антитіло);

• ізотонічний розчин натрію хлориду;

• досліджувана (підозріла) культура (невідомий антиген).

Алгоритм проведення та обліку орієнтовної РА на склі:

1. Знежирте предметне скло.

2. Нанесіть маркером три кола діаметром близько 1 см на однаковій відстані одне від одного. Переверніть скло.

3. Підпишіть:

   • під І колом — Д (дослід);

   • під ІІ — КС (контроль сироватки);

   • під ІІІ — КА (контроль антигену);

   • зазначте номер аналізу.

4. Зафламбуйте предметне скло і покладіть його у кришку чашки Петрі.

5. Нанесіть пастерівською піпеткою:

   • на кола Д і КС — по 1 краплі аглютинуючої сироватки;

   • на коло КА — 1 краплю ізотонічного розчину натрію хлориду.

6. Розітріть і змішайте бактеріологічною петлею досліджувану культуру з краплею ізотонічного розчину (коло КА).

7. Змішайте досліджувану культуру з краплею сироватки (коло Д).

8. Оцініть результати через 1–3 хв.

Облік результатів (починати з контролів!):

• КА — рівномірне помутніння.

• КС — крапля прозора.

• Позитивна реакція — у колі Д з’являються пластівці на фоні прозорої рідини (антиген відповідає антитілу).

• Негативна реакція — рівномірне помутніння (антиген не відповідає антитілу).

Іноді результат оцінюють за допомогою лупи або мікроскопа (мікроаглютинація).

1. Після обліку помістіть предметне скло в дезінфекційний розчин.

Проведення розгорнутої реакції аглютинації. Облік та оцінювання її результатів

Мета: серологічна діагностика інфекційних хвороб (реакція Відаля — черевний тиф; реакція Райта — бруцельоз тощо), визначення титру аглютинуючої сироватки, ідентифікація культур (E. coli, бруцели тощо).

Інгредієнти:

• сироватка крові хворого (невідоме антитіло);

• діагностикум (відомий антиген);

• ізотонічний розчин натрію хлориду.

Правила взяття крові для серологічного дослідження

• Кров беруть на 5–7-й день захворювання (коли накопичуються антитіла), у реконвалесцентів (ретроспективний діагноз) або у здорових (виявлення латентної інфекції/носійства).

• Натще або не раніше ніж через 6 год після їжі (щоб уникнути хільозної сироватки).

• Джерела: ліктьова вена, пучка IV пальця, мочка вуха; у грудних дітей — п’ятка.

• Дотримуйтесь асептики та техніки безпеки.

Оформлення:

• На пробірку наклеюють етикетку (номер, назва матеріалу, заклад/відділення, ПІБ хворого, дата і час взяття).

• Заповнюють бланк направлення (номер і назва матеріалу, заклад, кратність, ПІБ, вік, дата захворювання, попередній діагноз, мета дослідження, дата і час взяття, ПІБ та посада особи, що направляє).

Техніка взяття крові:

1. Одягніть маску і рукавички.

2. Обробіть шкіру ліктьового згину двома ватними тампонами, змоченими 70 % етиловим спиртом.

3. Візьміть стерильним шприцом 3–5 см³ крові.

4. Зніміть голку і обережно вилийте кров по стінці стерильної пробірки (краще «Епендорф»).

5. Закрийте пробірку гумовою пробкою.

6. Доставте в лабораторію не пізніше 2–3 год у контейнері/біксі з адсорбційною серветкою. Направлення упаковуйте окремо (не обертайте навколо пробірки!).

Отримання сироватки:

• Пробірку з кров’ю поставте в термостат (37 °C) на 30 хв (довше — гемоліз!).

• Відокремте згусток стерильною запаяною пастерівською піпеткою або скляною паличкою.

• Поставте в холодильник (4–10 °C) на 1–2 год (краще 18–20 год) або центрифугуйте.

• Сироватка над згустком зберігається не довше 48 год.

• Для тривалого зберігання (до 1 міс у холодильнику) — відсмокчіть сироватку в стерильну пробірку.

• Головна вимога — прозорість сироватки.

Підготовка діагностикуму:

• Перевірте цілість посудини, чіткість напису, відповідність інструкції, зовнішній вигляд і термін придатності.

• Рідкий — збовтайте; ліофілізований — розчиніть. Має бути рівномірно каламутним, без пластівців.

Алгоритм проведення розгорнутої реакції аглютинації

1. Підберіть 7 аглютинаційних пробірок однакового розміру, кольору скла та конфігурації дна + 1 пробірку для робочого розведення (Рр).

2. Візьміть стерильні градуйовані піпетки (5 см³ і 1 см³) та 1 пастерівську піпетку.

3. Поставте 3 стерильні пробірки і позначте, для яких піпеток вони призначені. Розгорніть піпетки і поставте у відповідні пробірки (піпетки зберігаються до кінця досліду!).

4. Підпишіть пробірки:

   • І — номер, вид антигену, 1:50;

   • ІІ — 1:100;

   • ІІІ — 1:200;

   • IV — 1:400;

   • V — 1:800;

   • VI — КС (контроль сироватки);

   • VII — КА (контроль антигену);

   • окрема — Рр (робоче розведення).

5. Внесіть:

   • у Рр — 4,9 см³ ізотонічного розчину натрію хлориду (піпеткою 5 см³);

   • у дослідні (крім першої і КС) — по 1 см³.

6. Внесіть 0,1 см³ досліджуваної сироватки в Рр, перемішайте (розведення 1:50).

7. Внесіть по 1 см³ розведеної (1:50) сироватки в пробірки І, ІІ і КС.

8. Перемішайте і перенесіть 1 см³ з ІІ → ІІІ → IV → V, а 1 см³ з V вилийте в дезінфекційний розчин.

9. Додайте пастерівською піпеткою по 2 краплі діагностикуму в кожну пробірку крім КС (однакова кількість!).

10. Струсіть пробірки і поставте в термостат (37 °C) на 2 год.

11. Проведіть попередній облік, залиште при кімнатній температурі.

12. Остаточний облік — через 18–20 год.

Облік результатів розгорнутої РА

Починати з контролів:

• КС — рідина прозора.

• КА — рівномірне помутніння або осад у вигляді ґудзика; при збовтуванні — рівномірне помутніння (негативна реакція).

Оцінка дослідних пробірок (порівнювати послідовно):

Позитивним вважають результат ++++ або +++.
Останнє розведення, в якому реакція позитивна, — титр сироватки.
Діагностичним здебільшого вважають титр 1:100.

Важливо: реакцію повторюють через 1–2 тижні. При захворюванні титр зростає у 2–4 рази. Це дозволяє відрізнити хворого від осіб, які перехворіли або були вакциновані (у них зростання титру немає).

Реакція зв’язування комплементу (РЗК)

Суть: Комплекс «антиген + антитіло» зв’язує комплемент. Якщо комплемент зв’язаний — гемоліз еритроцитів не відбувається (позитивна реакція). Якщо комплекс не утворився — комплемент вільний і викликає гемоліз (негативна реакція).

Основні компоненти: сироватка хворого, антиген, комплемент, гемолітична система (еритроцити + гемолізин).

Застосування: діагностика сифілісу (реакція Вассермана), вірусних і деяких бактеріальних інфекцій.

Реакція імунофлюоресценції (РІФ)

Суть: Антитіла, мічені флюорохромом (наприклад, флуоресцеїном), зв’язуються зі специфічним антигеном. Під люмінесцентним мікроскопом видно світіння.

Види:

• Пряма — мічені антитіла безпосередньо до антигену.

• Непряма — спочатку немічені антитіла, потім мічені антиглобулінові сироватки.

Застосування: швидка діагностика вірусів, бактерій, хламідій, рикетсій; виявлення антигенів у тканинах і мазках.

Реакція нейтралізації (РН)

Суть: Антитіла нейтралізують біологічну активність антигену (токсину, вірусу). Після змішування сироватки з токсином/вірусом суміш вводять чутливій тварині або культурі клітин.

Результат:

• Позитивний — тварина/клітини залишаються живими (антитіла нейтралізували токсин/вірус).

• Негативний — розвивається патологічний ефект.

Застосування: діагностика вірусних інфекцій, визначення антитоксичного імунітету (дифтерія, правець), титрування сироваток.