Практичне заняття №2. ПРОСТІ ТА СКЛАДНІ МЕТОДИ ФАРБУВАННЯ ПРЕПАРАТІВ.

Поняття про тинкторіальні властивості мікроорганізмів.

Виявлення патогенних мікроорганізмів в патологічному матеріалі за допомогою мікроскопа називається мікроскопічним методом лабораторної діагностики.

Для мікроскопії використовують мокротиння, гній, кров, осад спинномозкової рідини і сечі, мазки зі слизових оболонок, зскрібок з уражених ділянок шкіри, уражене волосся, нігті, а також відбитки уражених органів.

Мікроорганізми мають настільки малі розміри, що вивчати їх у незабарвленому вигляді під світловим мікроскопом неможливо, до того ж вони прозорі. Тому частіше їх вивчають у забарвленому стані. Вивчення мікроорганізмів у пофарбованому препараті дає змогу не тільки вивчити їх форму, розміщення, а й виявити деталі структури клітини (спору, капсулу), а також хімічний склад, через те, що різні хімічні речовини проявляють різну спорідненість до барвників і після фарбування мають різний колір або різну інтенсивність забарвлення.

Здатність мікроорганізмів сприймати барвники називають тинкторіальною (від лат. ііпсіига — настоянка) властивістю.

Виготовлення мазків-препаратів із патологічного матеріалу.

Для виявлення мікроорганізмів у патологічному матеріалі готують мазки на предметному склі. Предметні стекла готують заздалегідь. їх миють, знежирюють і зберігають в етиловому спирті або суміші Нікіфорова (суміш етилового спирту та діетилового ефіру 1:1) у широкогорлій банці з притертою пробкою. Перед роботою їх витирають насухо. Тримати скло слід І і II пальцями лівої руки за ребра.

Виготовлення мазока із в'язкого матеріалу (мокротиння або гною).

• Увага! Під час роботи з патологічним матеріалом завжди треба дотримуйтесь техніки безпеки.

Алгоритм "Виготовлення мазка із в'язкого матеріалу":

1. протріть насухо 2 знежирених предметних стекла;

2. поставте свій номер у верхньому лівому куті кожного скла;

3. нанесіть пастерівською піпеткою патологічний матеріал на середину скла;

4. накрийте його другим склом так, щоб 1/3 частина кожного скла була вільною, злегка притисніть ;

5. розведіть стекла в різні сторони, взявши їх за вільні кінці І і II пальцями обох рук;

6. залиште мазки на столі для висихання.

Виготовлення мазока із крові.

Алгоритм "Виготовлення мазка із крові":

1. підготуйте 2 предметних стекла (одне з них повинно бути вужчим і мати шліфований вузький кінець);

2. поставте свій номер на ширшому склі;

3. нанесіть краплю крові пастерівською піпеткою на ширше скло ближче до правого кінця; поставте друге скло шліфованим кінцем у краплю крові, нахиліть його вправо під кутом 45°;

4. проведіть ним по першому склу справа наліво на 3/4 скла;

5. опустіть вузьке скло в дезінфекційний розчин;

6. залиште мазок на столі для висихання.

• Увага! Правильно виготовлений мазок повинен мати світло-рожеве забарвлення і бути рівномірним за товщиною.

• Увага! Висушувати мазки слід на повітрі. Під впливом високої температури структура мікробної клітини порушується.

Прості методи фарбування

Використовується один барвник.

Найчастіші барвники:

• метиленовий синій;

• кристалічний фіолетовий;

• фуксин.

Особливості:

• усі мікроорганізми забарвлюються в один колір;

• швидкі та прості у виконанні;

• дають загальне уявлення про морфологію (форму) бактерій.

Коли застосовують:
оглядове дослідження, коли потрібно швидко побачити наявність мікробів.

Алгоритм "Фарбування препарату простим методом":

1. помістіть препарат на підставку в посудину для фарбування;

2. нанесіть барвник піпеткою так, щоб він закрив весь препарат;

3. проконтролюйте термін дії барвника (фуксин Пфейффера — 1—2 хв, метиленовий синій — 3—5 хв);

4. промийте препарат водою;

5. висушіть препарат фільтрувальним папером.

Складні методи фарбування

Використовується кілька барвників і реактивів у певній послідовності.

Основні методи:

1. Метод Грама (найважливіший)

• Грамопозитивні бактерії → фіолетово-сині

• Грамонегативні бактерії → рожево-червоні

Метод фарбування мазків-препаратів за Грамом належить до складних методів, тому що на мазок наносять два барвники, один з яких є основним, а інший — додатковим. Ці методи називають ще диференціальними, оскільки вони дають змогу розрізнити окремі групи бактерій, а також виявити хімічний склад і структуру бактеріальної клітини.

Алгоритм "Фарбування за Грамом":

1. покладіть на мазок папірець, пофарбований за Синьовим, змочіть його водою — 2—3 краплі, витримайте 2 хв;

2. зніміть папірець пінцетом, нанесіть розчин Люголя — 1 хв (до почорніння);

3. нанесіть 96 % етиловий спирт — 20—ЗО с;

4. промийте водою;

5. нанесіть фуксин Пфейффера на 1—2 хв;

6. промийте водою;

7. висушіть препарат фільтрувальним папером.

2. Метод Циля-Нільсена

• Використовується для виявлення кислотостійких бактерій (мікобактерії туберкульозу).

• Кислотостійкі → червоні

• Некислотостійкі → сині

Для виявлення кислотостійких мікобактерій туберкульозу, лепри, а також деяких актиноміцетів застосовують фарбування препарату за Цілем—Нільсеном. У цих мікроорганізмів у клітинній стінці міститься багато (понад 40 %) ліпідів, воску, оксикислот, що зумовлює їх стійкість до кислот, лугів, спиртів. Вона також малопроникна для розведених барвників, тому для фарбування використовують концентрований барвник (фуксин Ціля), що містить протраву (5 % фенолу). Фарбування проводять при нагріванні (в кип'ячому шарі). За таких умов всі елементи препарату (клітини макроорганізму, стороння мікрофлора і кислотостійкі мікобактерії) набувають червоного кольору. Після оброблення препарату сульфатною кислотою і водою кислотостійкі мікобактерії залишаються червоного кольору, всі інші елементи препарату знебарвлюються. Другим барвником, розведеним метиленовим синім, фарбують без підігрівання, тому він всередину клітини кислотостійких мікобактерій не проникає і вони не змінюють червоного забарвлення. Всі інші знебарвлені елементи препарату набувають синього кольору. При мікроскопії на синьому фоні видно кислотостійкі мікобактерії червоного кольору.