Лабораторна діагностика хвороб спричинених сальмонелами.

Загальні відомості про сальмонели

Сальмонели (рід Salmonella) — грамнегативні палички родини Enterobacteriaceae, факультативні анаероби, рухливі (більшість видів мають перитрихіальні джгутики), не утворюють спор і капсул. Вони є збудниками сальмонельозів — гострих кишкових інфекцій, а також черевного тифу (S. Typhi) та паратифів (S. Paratyphi A, B, C).

Морфологічні властивості:

• Форма: прямі палички розміром 0,5–1,5 × 1–3,5 мкм

• Забарвлення за Грамом: грамнегативні

• Рухливість: більшість видів рухливі (окрім S. Gallinarum, S. Pullorum)

• Капсули та спори: відсутні

Антигенна структура:
Сальмонели мають O-антигени (соматичні, термостабільні), H-антигени (джгутикові, термолабільні) та у деяких сероварів — Vi-антиген (капсульний, вірулентний, характерний для S. Typhi). Серотипування за схемою Кауфмана–Уайта дозволяє ідентифікувати понад 2600 сероварів.

Матеріал для дослідження

Вибір матеріалу залежить від клінічної форми захворювання:

• Кал (фекалії) — основний матеріал при гастроентеритичній формі сальмонельоза, при черевному тифі з 7 дня хвороби

• Кров — при підозрі на черевний тиф, септицемію з 1 дня хвороби, серологія з 7 дня хвороби

• Сеча — при черевному тифі, бактеріоносійстві та ускладненнях починаючи з 7 дня хвороби

• Жовч — при черевному тифі(з 5 тижня хвороби), бактеріоносійстві

• Блювотні маси, промивні води шлунка — на ранніх стадіях

• Харчові продукти, змиви з об’єктів довкілля — при епідеміологічному розслідуванні

Правила забору: матеріал збирають до початку антибактеріальної терапії, у стерильний посуд. Кал — у контейнер з транспортним середовищем. Кров — 10–30 мл у флакон з жовчним або цукровим бульйоном (співвідношення 1:10).

Етапи лабораторної діагностики (бактеріологічний метод)

Бактеріологічний метод є «золотим стандартом» діагностики сальмонельозів.

Первинне (неселективне) збагачення

Мета — відновлення пошкоджених клітин сальмонел.
Середовище: забуферена пептонна вода (BPW).
Інкубація: 18–24 год при 36–38 °C.

Селективне збагачення

Мета — пригнічення супутньої мікрофлори та накопичення сальмонел.
Основні середовища:

• Середовище Раппапорта–Василіадіса (RVS / MSRV) — 41–42 °C, 18–24 год

• Тетратіонатний бульйон Мюллера–Кауфмана (MKTTn)

• Селенітовий бульйон, магнієве середовище

3.3. Посів на диференційно-діагностичні середовища

Вісмут-сульфітний агар (BSA) — докладніше

Вісмут-сульфітний агар (Bismuth Sulfite Agar) — класичне високоселективне і диференційне середовище, яке протягом десятиліть було одним з основних для виділення сальмонел.

Принцип дії:

• Бриліантовий зелений і солі вісмуту сильно пригнічують ріст більшості грампозитивних бактерій та багатьох грамнегативних (кишкової палички, протея, клебсієл тощо).

• Сульфіт натрію + цитрат вісмуту служать індикатором утворення сірководню. Сальмонели відновлюють сульфіт до сульфіду, який реагує з іонами вісмуту → утворюється чорний осад сульфіду вісмуту.

Вигляд колоній:

• Класичні колонії — чорні або темно-коричневі з характерним металевим (дзеркальним) блиском.

• Середовище під колонією і навколо неї забарвлюється в чорний колір.

• Колонії середнього розміру (2–4 мм), опуклі, з рівними краями.

Особливості росту окремих сероварів:

• Більшість сальмонел (S. Typhimurium, S. Enteritidis та інші) дають типові чорні колонії з яскравим металевим блиском.

• S. Typhi росте повільніше: колонії менші, чорні або сірувато-чорні, блиск слабший.

• Деякі штами можуть утворювати зеленувато-сірі колонії без чіткого чорного центру.

Режим інкубації:

• 35–37 °C

• Обов’язковий перегляд через 18–24 години і повторно через 48 годин (бо частина штамів росте повільно).

Переваги (чому середовище так цінували раніше):

• Дуже висока селективність — на ньому майже не ростуть супутні бактерії.

• Характерний «металевий блиск» дозволяє майже відразу запідозрити сальмонелу.

• Добре накопичує H₂S-позитивні штами.

Недоліки:

• Токсичне для ослаблених клітин сальмонел (особливо після холодового стресу).

• Не всі сучасні штами дають класичний блиск.

• Після 48 годин колонії можуть зливатися і втрачати характерний вигляд.

• Сьогодні його часто замінюють на XLD, SS-агар або хромогенні середовища, але в багатьох лабораторіях BSA досі використовують як одне з основних.

Класична схема роботи з BSA:

1. Посів з селективного збагачення (або безпосередньо з матеріалу) на вісмут-сульфітний агар.

2. Інкубація 24 і 48 годин.

3. Відбір чорних колоній з металевим блиском.

4. Пересів на середовище Олькеницького / TSI + біохімічний ряд.

5. Серотипування.

Отримання чистої культури та біохімічна ідентифікація

Підозрілі колонії пересівають на середовище Олькеницького (Kligler) або TSI і проводять тести:

Серологічна ідентифікація (серотипування)

Проводять реакцію аглютинації на склі з полівалентними та груповими O-сироватками (групи A, B, C, D, E), потім з H-сироватками. Визначають серовар за схемою Кауфмана–Уайта.

• S. Typhi — група D (O9), H-d, Vi-антиген

• S. Paratyphi A — група A (O2)

• S. Typhimurium — група B (O4)

• S. Enteritidis — група D (O9)

Схема лабораторної діагностики сальмонел

Додаткові та прискорені методи діагностики

1. Молекулярно-генетичні методи (ПЛР)
ПЛР та real-time ПЛР виявляють ДНК сальмонел за 2–24 години.
Переваги: висока чутливість і специфічність, швидкість.
Недоліки: не дає живого ізоляту для визначення чутливості до антибіотиків. При позитивному результаті рекомендується рефлекс-посів на культуру.

2. Серологічні методи
Реакція Відаля (Widal test) — виявлення антитіл до O- та H-антигенів.
РПГА з еритроцитарними діагностикумами.
Діагностичне значення має наростання титру в парних сироватках (інтервал 7–10 днів) у 4 і більше разів.

3. Імунологічні експрес-методи

• ІФА (ELISA)

• Латекс-аглютинація

• Імунохроматографічні тести (швидкі тести)

Порівняльна таблиця методів діагностики