Лабораторна діагностика РНК-вмісних вірусів.

Мета заняття:

1. знати методи культивування вірусів;

2. знати особливості взяття патологічного матеріалу для дослідження та його транспортування до вірусологічної лабораторії;

3. уміти відбирати патологічний матеріал для дослідження;

4. уміти оформляти супровідну документацію;

5. знати препарати для специфічного лікування та профілактики вірусних інфекцій.

Ознайомтеся з методами взяття матеріалу при вірусних інфекціях.

Важливою умовою успішного виділення вірусу є правильний відбір патологічного матеріалу і транспортування його до лабораторії. Відбирати матеріал слід у найбільш ранні строки після початку захворювання (при грипі — у перші 2 доби; в осіб, які контактували з хворим, — до появи у них симптомів інфекції; секційний матеріал — відразу після констатування факту смерті хворого).

Під час відбору проб слід дотримуватися правил асептики та техніки безпеки. Під час проведення маніпуляцій, які супроводжуються порушенням цілості шкіри та слизових оболонок, лабораторних досліджень, оброблення інструментарію і білизни, прибирання, розтину трупів тощо медичні працівники і технічний персонал користуються засобами індивідуального захисту (хірургічними халатами, гумовими рукавичками, масками, а в разі потреби — захисним екраном, непромокальними фартухами, нарукавниками, окулярами). Ці дії дають змогу уникнути контакту шкіри та слизових оболонок працівника з кров'ю, тканинами, біологічними рідинами пацієнта.

Матеріал відбирають у стерильний посуд. Для цього використовують пробірки з кришками, що загвинчуються. Для запобігання забрудненню матеріалу бактеріальною мікрофлорою його відбирають в умовах, що максимально наближені до стерильних. Щоб запобігти підсиханню матеріалу й інактивації збудника, проби рекомендують вміщувати у транспортувальне середовище для вірусів (ВТС). До складу ВТС входять: розчин Хенкса (рН 7,4), захисний стабілізуючий агент — сироватковий альбумін великої рогатої худоби, пеніцилін, стрептоміцин і індикатор — феноловий червоний. Тип проби визначається характером захворювання, тропністю збудника до певних органів і систем та періодом перебігу інфекційного процесу. При ГРВІ відбирають назофарингеальні зразки, що містять циліндричні епітеліальні клітини носа і ротоглотки. Назофарингеальні зразки можна взяти одним із трьох способів: полосканням, аспірацією або за допомогою тампона.

Під час полоскання хворому рекомендують старанно прополоскати горло 15—20 см3 розчину Хенкса або середовища 199, Ігла протягом 1 хв і зібрати змив у стерильний флакон. Для полоскання можна використати стерильний забуферений ізотонічний розчин натрію хлориду, а потім внести його у ВТС.

Під час аспірації шприцом через надітий на нього тонкий гумовий зонд у ніс вводять декілька сантиметрів кубічних стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду, потім цю рідину відсмоктують, вміщують у центрифужну пробірку з ВТС і загвинчують кришку пробірки. Найчастіше матеріал відбирають за допомогою тампона. Для цього треба мати для одного хворого 2 стерильних сухих ватних (або марлевих) тампони окремо для носа та для ротоглотки. Перед взяттям матеріалу проводять маркірування пробірок з транспортувальним середовищем для вірусів. Спочатку ніс звільняють від слизу. Потім сухий стерильний тампон вводять у порожнину носа хворого по зовнішній стінці, злегка опускають донизу, вводять у нижній носовий хід на глибину 2—3 см, натискають тампоном на зовнішню стінку носа і обертовим рухом знімають десквамований епітелій (епітелій, що злущується з поверхні тканини). Потім тампон опускають у пробірку з 2 см3 середовища ВТС або фосфатного буферного розчину. Другим стерильним тампоном протирають слизову оболонку задньої стінки глотки (докладаючи зусиль, щоб зняти частину епітеліальних клітин). Тампон вміщують у ту саму пробірку з ВТС, закривають пробкою і маркірують. Пробірку з матеріалом охолоджують у холодильнику до 4 °С і доставляють до лабораторії в термосі з льодом, не допускаючи заморожування (при грипі — не пізніше 4 год). У лабораторії ВТС центрифугують 20 хв при 2—3 тис. об/хв і за температури 4 °С. Надосадову рідину використовують для зараження курячих ембріонів і культур клітин, а осад — для проведення імунофлюоресцентної мікроскопії.

Інший патологічний матеріал відбирають переважно за загальноприйнятими методиками, але є деякі особливості.

Спинномозкову рідину відбирають у кількості 1—2 см3, домішки еритроцитів і інших клітинний елементів видаляють центрифугуванням, віруси виділяють з надосадової рідини.

Проби калу відбирають у стерильні флакони з-під пеніциліну, масою 8—10 г (розміром з кісточку сливи). Флакони щільно закривають гумовими пробками. Отримані фекалії розводять розчином Хенкса у співвідношенні 1:10. Для отримання рівномірної суспензії флакон загортають у серветку, яка змочена 70 % розчином етилового спирту, струшують протягом 3—5 хв і центрифугують. Для виділення вірусу відбирають надосадову рідину. Якщо матеріал відбирають ректальним тампоном, його попередньо змочують у ВТС, вводять у пряму кишку обертальним рухом. Після взяття матеріалу тампон вміщують у пробірку з ВТС, відмивають, віджимають і занурюють у дезінфекційний розчин. Отриману завись у пробірці обробляють так само, як суспензію калу.

Кров на вірусологічне дослідження беруть із вени в об'ємі 5—10 см3, краще під час гарячки. Для запобігання згортанню кров дефібринують (струшують зі скляними паличками або додають 1 МО гепарину на 1 см3 крові). Нерозведену кров не замо-роясують і антибіотики не додають.

Кров на серологічне дослідження беруть у об'ємі 3—5 см3. Для отримання парних сироваток кров беруть з інтервалом 12—14 діб: першу пробу на початку захворювання, другу — через 2 тиж. Для отримання сироватки кров поміщають у термостат за 37 °С, утворений згусток відділяють від стінок пробірки скляною паличкою або пастерівською піпеткою.

Для збільшення виходу сироватки пробірки із кров'ю, що згорнулася, ставлять у холодильник за температури 4 °С на 18—24 год. Для видалення решти домішок кров центрифугують, потім сироватку переносять у стерильну пробірку і зберігають у замороженому стані до отримання другої проби. Дві проби сироватки досліджують одночасно. Сеча. Збирають середню порцію сечі в об'ємі 10 см3, охолоджують до 4 °С, центрифугують, надосадову рідину виливають у дезінфекційний розчин, а осад вміщують в 1 см3 ВТС. Осад у ВТС зберігають за 4 °С протягом не більше ніж 48 год перед доставкою до лабораторії. В іншому випадку його заморожують у ВТС за —70 °С і відправляють у пакетах із сухим льодом. Рідину із серозних оболонок беруть в об'ємі 2 см3. Для виділення вірусів її використовують відразу (додаткового оброблення не потребує) або зберігають замороженою.

Мазок із кон'юнктиви беруть сухим стерильним тампоном і вміщують у ВТС. Після центрифугування використовують відразу або зберігають замороженим. Вміст везикул. Поверхню шкіри обробляють ефіром або ацетоном. Вміст везикул відсмоктують шприцом із тонкою голкою і переносять у ВТС. Іноді везикули розтинають і вміст відбирають стерильним ватним тампоном, який вміщують у ВТС.

Секційний матеріал відбирають у найбільш ранній термін після смерті хворого. Щоб уникнути контамінації матеріалу бактеріальною мікрофлорою, матеріал відбирають у певній послідовності. Спочатку беруть проби позапорожнинних тканин (лімфатичні вузли, мозок), потім тканини грудної порожнини (до початку розтину черевної порожнини) і в останню чергу — з черевної порожнини. Шматочки тканин масою 1—3 г поміщають у окремі стерильні флакони. Отримані шматочки тканин розтирають у стерильній ступці з додаванням стерильного піску, додають розчин Хенкса у співвідношенні 1:10, центрифугують. До освітленої рідини додають антибіотики і використовують для виділення вірусів негайно або зберігають за температури 20 °С.

На санітарно-вірусологічне дослідження відбирають матеріал з довкілля: ґрунт, воду, молоко і молочні продукти, овочі, фрукти, а також тварин, в організмі яких можуть перебувати віруси (кліщі, молюски, риба тощо). Здійснення вірусологічного нагляду за об'єктами навколишнього середовища потрібне для визначення інтенсивності циркуляції вірусів на певній території, їх типового складу, оцінки ефективності роботи щодо оздоровлення навколишнього середовища.

Вирішить ситуаційні задачі:

Задача №1.

Під час епідемії грипу до лікаря звернувся пацієнт із високою температурою, ознобом та сухим кашлем. Для підтвердження діагнозу було вирішено провести ПЛР-тестування. Відомо, що вірус грипу належить до РНК-вмісних вірусів.

1. Який обов’язковий етап має передувати полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР), щоб виявити цей вірус?

2. Який фермент для цього використовується?

Задача №2.

Під час аналізу структури невідомого вірусу було виявлено: капсид, ліпідну суперкапсидну оболонку та одну нитку нуклеїнової кислоти, що містить урацил.

1. До якої групи за складом нуклеїнових кислот належить цей вірус?

2. Яким є цей вірус за будовою (простим чи складним)?

Алгоритм "Підготовка матеріалу для транспортування до лабораторії":

1. помістіть пробірку разом із шматочком вати у пластико-вий пакет меншого розміру;

2. помістіть зразок від одного обстежуваного у пластиковий пакет більшого розміру;

3. помістіть пакети у термоізолюючий контейнер, обкладіть їх ватою;

4. закрийте щільно контейнер, заклейте кришку і верхню частину контейнера клейкою стрічкою;

5. покладіть направлення в окремий пластиковий пакет, прикріпіть його до контейнера.