Лабораторна діагностика хвороб, спричинених патогенними рикетсіями, хламідіями, мікоплазмами.

Мета заняття:

• знати особливості взяття патологічного матеріалу на дослідження та його транспортування до бактеріологічної лабораторії, оформлення супровідної документації;

• знати методи мікробіологічної діагностики.

1. Загальна характеристика та порівняння збудників

Рикетсії, хламідії та мікоплазми — атипові бактерії, які відрізняються від типових прокаріотів:

• Рикетсії (родина Rickettsiaceae та Coxiellaceae): облігатні внутрішньоклітинні паразити, грам-негативні, паличкоподібні або кокобактерії (0,3–0,6 × 0,8–2,0 мкм). Потребують живих клітин для розмноження (ендотеліоцити судин). Передача — через членистоногих (воші, блохи, кліщі). Викликають висипні тифи, плямисті гарячки, Ку-гарячку.

• Хламідії (родина Chlamydiaceae): облігатні внутрішньоклітинні паразити з унікальним циклом розвитку (елементарні тіла → ретикулярні тіла). Грам-негативні, але фарбуються спеціально. Викликають трахому, урогенітальний хламідіоз, пневмонії, орнітоз.

• Мікоплазми (родина Mycoplasmataceae): найменші вільноживучі бактерії, без клітинної стінки (тільки цитоплазматична мембрана з холестерином). Поліморфні (кокоїдні, ниткоподібні). Викликають атипові пневмонії, урогенітальні інфекції, безпліддя.

Порівняльна таблиця:

2. Теорія: Особливості морфології та циклів розвитку

Рикетсії: Дрібні палички або кокобактерії. Фарбуються за Здродовським — рикетсії стають рубіново-червоними, цитоплазма клітини — голубою, ядро — синім.

Хламідії: Мають два форми:

• Елементарні тіла (ЕТ) — інфекційна форма, стійка, 0,2–0,3 мкм.

• Ретикулярні тіла (РТ) — репродуктивна форма, більша, метаболічно активна.

Цикл розвитку хламідій (приблизно 48–72 години):

Мікоплазми: Поліморфні клітини без стінки, часто з «фрігг»-структурами (термінальні структури для адгезії). На середовищах утворюють характерні «яєчне» або «малиноподібні» колонії.

3. Лабораторна діагностика

А. Рикетсіози (висипний тиф, Ку-гарячка тощо)

Патологічний матеріал: кров, сироватка, при Ку-гарячці — мокротиння, сеча, молоко, тканини.

Методи:

1. Мікроскопічний — виявлення в мазках крові або тканин (за Здродовським). Рідко використовується.

2. Біологічний — зараження курячих ембріонів або лабораторних тварин (морські свинки).

3. Серологічний (основний):

   • Реакція Вейля-Фелікса (з антигенами Proteus OX19, OX2, OXK) — історичний.

   • Реакція аглютинації з рикетсіями (РА).

   • РЗК (реакція зв’язування комплементу).

   • РНГА, ІФА, непряма імунофлуоресценція (РІФ) — сучасні.

4. Молекулярний — ПЛР (виявлення ДНК в крові).

Схема діагностики рикетсіозів: мікроскопія → культивування в ембріонах → серологія (парні сироватки з наростанням титру в 4 рази).

Б. Хламідіози (урогенітальний, трахома, пневмонія, орнітоз)

Патологічний матеріал: зскріби з кон’юнктиви, уретри, цервіксу, центрифугат сечі, мокротиння, біоптати.

Методи:

1. Мікроскопічний — виявлення цитоплазматичних включень у епітеліальних клітинах (за Романовським-Гімзою або Мачіавелло). Класичний для трахоми.

2. Експрес-методи — пряма/непряма РІФ з моноклональними антитілами (виявлення антигенів).

3. Культивальний — на культурі клітин (McCoy, HeLa) або курячих ембріонах (рідко).

4. Молекулярний — ПЛР (найчутливіший і специфічний метод для виявлення ДНК Chlamydia trachomatis, C. pneumoniae, C. psittaci).

5. Серологічний — ІФА, РЗК, мікроімунофлуоресценція (виявлення IgM/IgG).

Схема: зскрібок → мікроскопія/РІФ → ПЛР → серологія (при системних формах).

В. Мікоплазмози (M. pneumoniae, M. hominis, Ureaplasma urealyticum)

Патологічний матеріал: мокротиння, зскріби з урогенітального тракту, сеча.

Методи:

1. Мікроскопічний — слабко інформативний (поліморфні клітини).

2. Культивальний (основний для ідентифікації) — посів на спеціальні середовища з холестерином і сироваткою (PPLO-агар). Колонії «яєчне» (fried-egg colonies) через 5–14 днів.

3. Молекулярний — ПЛР (найшвидший і чутливий).

4. Серологічний — ІФА, реакція холодової аглютинації (для M. pneumoniae), РЗК.

Схема: посів на спеціальне середовище → ідентифікація колоній → ПЛР або серологія.

Для діагностики ендемічного висипного тифу використовують серологічний і біологічний методи.

Для серологічної діагностики використовують PAP і РЗК. їх ставлять так само, як і відповідні реакції при епідемічному висипному тифі, але використовують діагностикум, виготовлений із R. typhi. Ці реакції дають змогу діагностувати ендемічний висипний тиф і провести диференціацію ендемічного й епідемічного висипного тифу.

Біологічний метод здебільшого використовують для диференціації епідемічного й ендемічного висипного тифу. Кров'ю хворого заражають самців морської свинки внутрішньооче-ревинно. Рикетсії Провачека спричинюють у них гарачку, а R. typhi — скротальний феномен (рикетсійний періорхіт).

Оптимальними ділянками для розмноження хламідій є циліндрічний епітелій сечостатевих органів: у чоловіків — передній відділ сечівника на глибині 2,5—4 см, у жінок — сечівник і слизова оболонка каналу шийки матки на глибині 1,5 см. Зскрібки зі слизових оболонок сечостатевого каналу у чоловіків відбирають одноразовим зондом (щіточкою, ложечкою Фолькмана або жолобуватим зондом) обертальним рухом на відстані 2—4 см у ділянці човноподібної ямки. Напередодні допускається провокація (гостра їжа, алкоголь), за 4—5 год до взяття матеріалу пацієнту слід утримуватись від випускання сечі. У жінок матеріал відбирають перед або не раніше ніж через 14 діб після менструації. Зскрібки беруть після вилучення слизової пробки із піхвової частини шийки матки, а також із сечостатевого каналу на глибині 0,5—1,5 см. Інструменти для взяття проб обережно вводять у цервікальний канал, не торкаючись стінки піхви, і легким рухом (не до крові!) відбирають матеріал. Зскрібок із кон'юнктиви (верхньої і нижньої повік) беруть затупленим очним скальпелем після анестезії 0,5 % розчином дикаїну. Зскрібки з носових ходів відбирають зондами або ватним тампоном. Досліджують також матеріали, отримані під час діагностичних пункцій, біопсій, хірургічним шляхом, а також секрети статевих залоз, кров, синовіальну рідину суглобів, змиви з бронхів.

Для діагностики використовують мікроскопічний, бактеріологічний, серологічний, алергійний і молекулярногенетичний методи.

Мікроскопічний метод. Одразу після взяття матеріал обертальними рухами наносять на поверхню ямки чистого знежиреного предметного скла так, щоб усі боки тампона торкалися поверхні скла. Мазок висушують на повітрі протягом 20—30 хв і фіксують холодним (4 °С) абсолютним хімічно чистим ацетоном упродовж 5—10 хв. Мазок фарбують за Романовським— Гімзою. В уражених клітинах виявляють цитоплазматичні включення, що утворюються хламідіями. Це зернисті структури, що містять збудника на різних етапах його розмноження. Включення, що містять ретикулярні тільця, забарвлюються в синьо-фіолетовий колір, елементарні тільця (зрілі) — в рожево-червоний. Одним із найбільш доказових, але і трудомістких є культу-ральний метод (бактеріологічний). Його проводять тільки в спеціалізованих лабораторіях. Для виділення хламідій використовують культуру клітин НеЬа-229, ВНК-21 у вигляді моно-шару на покрівному склі. Інкубують матеріал за 37 °С протягом 48—72 год. Збудника виявляють під мікроскопом у разі фарбування препарату за Романовським—Гімзою.

Серологічний метод використовують для виявлення антитіл у РНІФ, ІФА, РЗК, РИГА.

Для проведення молекулярно-генетичного дослідження використовують ДНК-зондову гібридизацію та ЛПР. Розроблені і застосовуються імунохроматографічні експрес-методи. Тривалість аналізу становить 10—30 хв, але чутливість і специфічність експресаналізів набагато нижча від традиційних.

Для дослідження відбирають мокротиння, змиви з бронхів, кров, спинномозкову рідину, а також матеріал із сечостатевих органів.

Використовують бактеріологічний і серологічний методи діагностики.

Під час бактеріологічного методу посіви виконують у рідке і на щільне спеціальні для мікоплазм поживні середовища. Посіви інкубують за температури 36,5—37 °С протягом 24—48 год. Результат вважають позитивним, якщо після закінчення терміну інкубації колір середовища змінюється від жовтого до рожевого за відсутності каламуті. На щільному поживному середовищі (це саме рідке середовище + агар) посіви інкубують 5 діб в умовах підвищеного вмісту С02. Колонії розглядають під мікроскопом (об'єктив х40). Виділену культуру ідентифікують за культуральними, морфологічними та біохімічними властивостями. Для їх типуван-ня використовують реакції пригнічення росту або метаболізму специфічними імунними сироватками. Для виявлення мікоплазм у спермі використовують реакцію імунофлюоресценції.

Для серологічного методу діагностики використовують ІФА, реакцію агрегатгемаглютинації (РАГА), РПГА.

Ситуаційні задачі

1. Після зараження самця морської свинки кров'ю хворого з підозрою на висипний тиф у тварини розвинувся періорхіт. Який висновок слід зробити і які дослідження провести для уточнення діагнозу?

2. Для діагностики висипного тифу використовують РАР. Під час постановки реакції на 6-й день після захворювання титр сироватки становив 1:80, через 10 діб — 1:640. У скільки разів збільшився титр сироватки? Чи підтвердився діагноз?