Методи дослідження спадковості людини

Інструктивна карта практичного заняття №6

Тема: «Методи дослідження спадковості людини»

Студент повинен знати:

1. Генеалогічний метод. Типи успадкування ознак.

2. Близнюковий метод. Визначення впливу генотипу та довкілля у прояві патологічних ознак людини.

3. Цитогенетичний метод та метод визначення статевого хроматину.

4. Популяційно-статистичний метод.

5. Метод дермагліфіки.

6. Біохімічний та молекулярно-генетичний методи.

7. Пренатальна діагностика спадкових патологій.

8. Методи пренатального скринінгу та хромосомних хвороб.

Студент повинен вміти:

1. Складати схему родоводів та аналізувати їх.

2. Розрізняти каріотипи людини в нормі і патологі

3. Складати варіаційний ряд і відображувати його графічно.

4. Виявляти групи ризику для направлення до медико-генетичного консультування.

Підручник: «Медична біологія»-

В.В.Барціховський, П.Я.Шерстюк, 2020, с.111-138.

Опрацюйте теоретичний матеріал. Заплануйте на повторення матеріалу 30 хвилин

Тема: »Методи дослідження спадковості людини».

ГЕНЕАЛОГІЧНИЙ МЕТОД

Ознайомтесь з принципами складання родоводів і основними позначеннями, які використовують в генеалогічному методі.

Генеалогія - вчення про родоводи. Суть генеалогічного методу полягає у вивченні спадковості людини шляхом урахування та аналізу спадкових ознак у низці поколінь пробанда.

Цей метод увів у науку Ф. Гальтон у кінці XIX ст. Метод допомагає з'ясувати:

1. Дана патологія (ознака) в конкретній родині спадкова або набута.

2. За яким типом успадковується дана патологія в родині (аутосомно чи зчеплено зі статтю).

3. Генотип пробанда.

4. Гетерозиготне носійство патологічного гена.

5. Ймовірність народження хворої дитини в родині пробанда.

Недоліком цього методу є труднощі щодо збирання інформації. Значна кількість людей не знають про стан здоров'я і причини смерті навіть близьких родичів, тим більше - родичів подружжя. Тому, чим більше членів родини буде опитано, тим більше шансів на отримання достовірніших і повніших відомостей.

Пробанд - особа, від якої починають складати родовід; пацієнт, який звернувся до лікаря-генетика. Він може бути як хворим, так і здоровим.

Рідних братів і сестер пробанда називають сибсами.

Генеалогічний метод умовно поділяють на два етапи:

- графічне складання родоводу

- генеалогічний аналіз родоводу ( легенда родоводу).

Усі відомості про пробанда збирають у хронологічному порядку. Зібравши відомості про пробанда, переходять до збору даних про його сибсів. Важливо знати, скільки було дітей в родині, скільки померло і з яких причин, як фізично і розумово розвивалися діти, як і на що вони були хворі, за яких обставин захворіли і померли. Аналітичні відомості збирають на кожного сибса, обов'язково вказують вік батьків до моменту народження кожного з сибсів. Під час збору відомостей про батьків і родичів пробанда особливу увагу приділяють віку, національності, місцю проживання родини, місцю проживання предків, професії, наявності хронічних захворювань.

Після збору аналітичних даних починають об'єктивне обстеження пробанда і його родичів, яке полягає в детальному огляді з описом фенотипових проявів захворювання. Ретельний клінічний огляд хворого і його родичів з урахуванням симптомів (мікроаномалій), дає змогу встановити діагноз або запідозрити різні спадкові хвороби.

Під час клінічного огляду пробанда потрібно врахувати всі вади розвитку, оскільки висока ймовірність генетичної схильності до різних захворювань фенотипово часто проявляється як мікроаномалії розвитку.

Після збору генеалогічних даних починають складати родовід.

Родовід - це графічне зображення родинного дерева.

Правила складання родоводу:

1. Починати складати родовід краще з центру аркуша, щоб бокові гілки родоводу не виходили за його межі.

2. Складати родовід потрібно з пробанда. Порядок складання родоводу - від наступних до попередніх поколінь; спочатку - покоління пробанда і його дітей, а потім - його батьки. Кожне попереднє покоління зображують вище від лінії пробанда, а наступне - нижче. Всіх членів родоводу треба розташовувати чітко за поколіннями в один ряд.

3. Для зручності складання родоводу спочатку вказують родинні зв'язки по материнській лінії пробанда, після цього зображують лінію батька.

4. Біля символу кожного члена родини вказують його вік.

5. Особисто обстежених членів родини позначають знаком оклику "!".

6. Зліва кожне покоління позначають римською цифрою, а всі індивіди в цьому поколінні - арабськими цифрами.

7. Необхідно поставити дату, коли було складено родовід.

8. Додати до родоводу легенду (опис родоводу).

Після складання родоводу починають його аналізувати.

Аналіз родоводу

1. Установити: дана ознака чи захворювання в родині лише поодиноке або виявлено кілька випадків даної патології в родині (родинний характер); а також чи дане захворювання є спадковим або набутим.

2. Визначити тип успадковування даної хвороби (ознаки) в родині (зчеплений зі статтю — хворіють найчастіше представники тільки однієї статі; аутосомний — хворіють однаково часто представники обох статей ).

3. З'ясувати, по якій лінії (батька чи матері) передається захворювання.

4. Визначити генотипи пробанда і його родичів.

5. Визначити ймовірність народження хворих дітей у родині пробанда.

6. Розробити план лікування і профілактики захворювання, дати пораду.

Умовні позначення дня складання родоводу

Типи успадкування ознак у людини

Автосомно-домінантний тип успадковування

Успадкування обумовлюється передачею в ряді поколінь домінантного алеля гена, розташованого в автосомі ( А- хвороба (ознака ), а – норма ). Йому властиві такі риси прояву:

• хворіти будуть особини з генотипом АА, Аа; здорові – аа;

• за достатньої кількості потомків, хвороба виявляється в кожному поколінні;

• особини чоловічої та жіночої статі успадковують хворобу однаково за частотою;

• якщо один із батьків хворий ( АА ), а інший здоровий ( аа ), то у них всі діти будуть хворі ( Аа );

• якщо один із батьків хворий, але гетерозиготний ( Аа ), а інший здоровий

( аа ), то у них 50 % дітей будуть хворі ( Аа ) і 50 % дітей – здорові ( аа );

• якщо обоє батьків хворі, але гетерозиготні ( Аа ), то у них 75 % дітей будуть хворі, а 25 % - здорові.

За домінантним типом успадковуються такі хвороби, як хорея Гентінгтона, полікистозна хвороба нирок дорослих, міопатична дистрофія, ахондроплазія, еліптоцитоз, гіперхолестеринемія, катаракта, полідактилія, брахідактилія, група крові, резус-фактор та ін.

Мал. Родовід із аутосомно-домінантним типом успадкування (брахідактилія, або короткопалість)

Аутосомно - рецесивний тип успадкування

Успадкування обумовлюється передачею в ряді поколінь рецесивного алеля гена, розташованого в автосомі ( А – норма, а – хвороба (ознака)). Для цього характерно:

• хворіти будуть особини з генотипом аа; АА – здорові, Аа – носії;

• навіть при достатньому числі нащадків ознака може бути відсутньою у дітей, але з’явиться в поколінні онуків;

• особини чоловічої та жіночої статі успадковують хворобу однаково за частотою;

• якщо один із батьків хворий ( аа ), а інший здоровий ( АА ), то у них всі діти будуть носії ( Аа );

• якщо один із батьків хворий ( аа ), а інший здоровий-носій ( Аа ), то у них 50 % дітей будуть носії ( Аа ) і 50 % дітей – хворі ( аа );

• якщо обоє батьків носії ( Аа ), то у них 25 % дітей будуть здорові ( АА ), а 50 % - носії ( Аа ) і 25% - хворі ( аа ).

За автосомно-рецесивним типом успадковуються такі хвороби, як дитяча амавротична ідіотія, пентозурія, фенілкетонурія, галактоземія, муковісцидоз, гіпотиреоз, хвороба Тея-Сакса, Гоше та ін.

Мал.Родовід із аутосомно-рецесивним типом успадкування (альбінізм)

Зчеплений зі статтю домінантний тип успадкування

Успадкування обумовлюється передачею в ряді поколінь домінантного алеля гена, розташованого в Х - хромосомі ( А- хвороба (ознака ), а – норма ). Йому властиві такі риси прояву:

• якщо батько хворий, то всі його дочки будуть хворими, а сини здоровими;

• хворими діти будуть тільки у випадку, коли хворий один з батьків;

• у здорових батьків всі діти будуть здоровими;

• захворювання реєструється в кожному поколінні;

• якщо мати хвора, то ймовірність народження хворої дитини складає 50 % незалежно від статі;

• хворіють як чоловіки, так і жінки, але хворих жінок у родині в два рази більше, ніж хворих чоловіків.

За зчепленим зі статтю домінантним типом успадковуються такі хвороби, як вітаміно-Д-резистентний рахіт, гіпоплазія зубів, фолікулярний кератоз та ін.

Мал. Родовід із Х-зчепленим домінантним типом успадкування (коричневе забарвлення емалі зубів)

Зчеплений зі статтю рецесивний тип успадкування

Успадкування обумовлюється передачею в ряді поколінь рецесивного алеля гена, розташованого в Х - хромосомі ( А- норма, а – хвороба ). Йому властиві такі риси прояву:

• хворіють переважно особи чоловічої статі;

• захворювання спостерігається у чоловіків-родичів пробанда по материнській лінії;

• син ніколи не успадковує захворювання батька;

• від шлюбу хворих чоловіків і здорових жінок всі діти будуть здоровими, але у дочок можуть бути хворі сини;

• від шлюбу між здоровим чоловіком і гетерозиготною жінкою ймовірність народження хворої дитини складає 50 % для хлопчиків і 0 % для дівчаток;

• якщо в окремих випадках хвороба виникає у жінки, то її батько обов’язково хворий, а мати є носієм.

За зчепленим зі статтю рецесивним типом успадковуються такі хвороби, як гемофілія, дальтонізм та ін.

Мал. Родовід із Х-зчепленим рецесивним типом успадкування (гемофілія)

У-зчеплене успадкування
У-зчеплене успадкування, або голандричне. Воно властиве тільки чоловічій статі. У-хромосома людини містить зовсім небагато генів, які передаються від батька тільки синам. При цьому ознака наявна в усіх поколіннях і у всіх чоловіків.Прикладом голандричного успадкування може бути успадкування гіпертрихозу (наявність волосся по краю вушних раковин )

Мал. Родовід із У-зчепленим типом успадкування (гіпертрихоз)

БЛИЗНЮКОВИЙ МЕТОД

Одним із перших методів вивчення генетики людини, який не втратив значення і натепер, є близнюковий.

Близнюковий метод - обстеження близнюкових пар з метою визначення ролі спадковості та середовища у розвитку ознак. Одночасно народжених особин в одноплідних тварин (кінь, велика рогата худоба тощо) та людини називають близнятами. Вони бувають монозиготними або дизиготними.

Монозиготні близнята розвиваються з однієї яйцеклітини, заплідненої одним сперматозооном, тому їх називають також однояйцевими. Такі близнята однієї статі та генетично абсолютно однакові, але можуть відрізнятися за фенотипом, що зумовлено дією чинників зовнішнього середовища. Монозиготні близнята мають однакові групи крові за системами ABO, MN, Rh та іншими, однаковий колір очей, однотипні візерунки на пальцях, а також лінії та візерунки на долонях тощо. Усі ці фенотипічні ознаки використовують як критерії визначення зиготності близнят. Дизиготні близнята розвиваються із двох одночасно дозрілих яйцеклітин, запліднених двома сперматозоонами, і тому їх називають також різнояйцевими. Такі близнята можуть бути однієї статі чи різностатевими, але спадково настільки різними, як і діти подружньої пари, що народилися у різний час. Натепер у середньому на кожні 100 пологів припадає одне народження близнят. Демографи обчислили, що на Землі проживає приблизно 50 млн пар близнят. Приблизно одну третину всіх близнят становлять монозиготні, а дві третини — дизиготні. Кількість монозиготних близнят у різних регіонах земної кулі є величиною відносно постійною з невеликими коливаннями (0,37— 0,40%). Це свідчить, що поява монозиготних близнят майже не залежить від умов зовнішнього середовища. Частота народження дизиготних близнят у різних країнах має значні коливання: від 0,23% (Японія) до 2,23% (Південна Африка). Причини такої різниці невідомі, проте вона свідчить про вплив середовищних чинників. У старших за віком подружжях дизиготні близнята народжуються частіше. Дослідження довели, що на народження близнят впливає і спадкова схильність до багатоплідної вагітності. Відомі випадки повторного народження близнят у одній сім'ї. Протягом останніх десятиріч кількість близнят, особливо дизиготних, знижується.

Дослідження людських близнят дає змогу отримати цінний матеріал для вивчення важливої загальнобіологічної проблеми — ролі генетичних факторів та умов навколишнього середовища у розвитку ознак. У генетиці людини умовами середовища вважають сукупність біосферних та соціальних чинників. Якщо досліджувана ознака наявна в обох близнюків однієї пари, то ця пара є конкордантною за цією ознакою. Зіставлення монозиготних і дизиготних близнят дає змогу визначити коефіцієнт парної конкордантності (С), який показує частку близнюкових пар, де досліджувана ознака виявилася в обох партнерів. Коефіцієнт конкордантності виражають у відсотках або у частках одиниці та визначають за формулою:

С^[Сп: (Сп + 2)я)] • 100% (у відсотках); С = Сп : (Сп + £)/г) (у частках одиниці),

де Сп — кількість конкордатних пар, Ип — кількість неконкордантних пар.

Порівняння парної конкордантності монозиготних та дизиготних близнят дає змогу з'ясувати співвідношення впливу генотипу та середовища у розвитку певної ознаки. Коли значення коефіцієнтів конкордантності монозиготних і дизиготних близнят близькі, то вважають, що розвиток ознаки визначається переважно умовами середовища. Якщо ступінь конкордантності у монозиготних близнят вищий ніж у дизиготних, це свідчить про домінуючу роль генетичних факторів у розвитку ознаки.

Конкордантність за деякими ознаками серед монозиготних (МБ) та дизиготних (ДБ) близнят людини (% )

З таблиці видно, що якщо один партнер має певну ознаку (у т. ч. захворювання), то вірогідність наявності цієї ознаки в іншого партнера у монозиготних близнюків значно вища, ніж у дизиготних. У разі захворювання на деякі інфекційні хвороби (кір, коклюш, вітряна віспа тощо) домінуючими є інфекційні чинники (середовище), а у разі захворювання на інші (туберкульоз, ревматизм, запалення середнього вуха тощо) суттєвий вплив має генотип.

Для кількісного оцінювання співвідношення впливу генотипу та середовища на досліджувану ознаку найчастіше користуються коефіцієнтом успадковуваності, який вираховують за формулою Хольцинґера:

Н=(( КМБ-КДБ ) : (100%-КДБ))х100%

де Н - коефіцієнт спадковості, КМБ - конкордантність монозиготних близнят (%), КДБ - конкордантність дизиготних близнят (%). Коефіцієнт спадковості виражають у частках одиниці або відсотках.

Величина коефіцієнта успадковуваності свідчить про співвідношення впливу генетичних факторів та середовища на розвиток ознаки. Якщо результат розрахунків наближається до 100% (71—100%), то загалом на розвиток ознаки впливає спадковість, і навпаки, чим ближчий результат до 0 (0—40%), тим більшим є значення чинників середовища. При значенні коефіцієнта успадковуваності в межах 41—70% ознака розвивається під дією факторів середовища, але за наявності генетичної зумовленості.

Генетичні дослідження, здійснювані на близнятах, дають змогу відповісти на низку важливих питань: вплив спадкових та середовищних чинників на тривалість життя людини, розвиток обдарованості, чутливість до лікувальних препаратів тощо.

ЦИТОГЕНЕТИЧНІ МЕТОДИ

Принципи цитогенетичних досліджень сформувалися протягом 20—30-х років XX ст. на класичному об'єкті генетики — мушці дрозофілі та деяких рослинах.

Цитогенетичні методи — вивчення клітин під мікроскопом з метою визначення кількості хромосом та їх будови у нормі та патології, а також локалізації генів у хромосомах.

Цитогенетичні методи часто застосовують у комплексі з іншими методами вивчення генетики людини, наприклад з генеалогічними. Вони досить складні і поширилися лише 20—ЗО років тому. До цитогенетичних методів належить аналіз каріотипу і гібридизація соматичних клітин.

Аналіз каріотипу

Метод аналізу каріотипу полягає у мікроскопічному дослідженні хромосом на метафаз-ній стадії мітозу. У людини найзручнішим об'єктом для цього є культивовані в спеціальному розчині лімфоцити периферійної крові. Досліджувані клітини піддають спеціальній обробці, в результаті якої хромосоми стають чіткими та віддаленими одна від одної. Важливим етапом є фарбування хромосом за допомогою різноманітних методик залежно від мети дослідження. Це дає змогу підраховувати їх і аналізувати. Нормальний каріотип людини містить 46 хромосом, із яких 22 пари аутосом та 2 статеві хромосоми.

Кожна хромосома при застосуванні особливого фарбника по своїй довжині диференціюється на темні та світлі смуги — т. зв. диски. Послідовність розташування цих дисків, їх форма специфічні для кожної хромосоми .

Мал. Схематичний вигляд диференційно фарбованих хромосом людини

Якщо порушення стосується статевих хромосом, то дослідження спрощується. У цьому разі не аналізують весь каріотип, а обстежують соматичні клітини на наявність у них статевого хроматину — невеликого дископодібного тільця, яке інтенсивно фарбується цитологічними барвниками. Його виявляють у інтерфазних клітинних ядрах безпосередньо під ядерною мембраною. Статевий хроматин — це спіралізована Х-хромосома, яка утворюється у жінок ще в ранньому ембріогенезі до розвитку статевих залоз. Його наявність можна визначити у будь-яких тканинах. Найчастіше досліджують епітеліальні клітини слизової оболонки щоки. У каріотипі нормальної жінки є дві Х-хромосоми, одна з них утворює тільце статевого хроматину. Кількість тілець статевого хроматину на одиницю менша, ніж Х-хромосом у особини (рис. 3.8). У жінок, які мають каріотип 45[Х0] (Х-моносомія; синдром Шерешевського — Тернера), ядра клітин не мають статевого хроматину. При синдромі Х-трисомії (47[ХХХ]) у жінки утворюються два тільця, у чоловіка з каріотипом 47[ХХУ] (синдром Кляйнфельтера) є одне тільце (як у нормальних жінок).

Мал. Статевий хроматин у ядрах клітин нормальних жінки (1) та чоловіка (2), а також у жінки з Х-трисомією (3)

Визначення статевого хроматину використовують і в судовій медицині, коли необхідно за плямами крові встановити статеву належність особи. Аналіз каріотипу широко застосовують для вивчення морфології хромосом людини в нормі та за патології, визначення їх кількості, дослідження процесу старіння тканин тіла, діагностування різноманітних захворювань спадкової природи тощо. За необхідності його здійснюють разом з генеалогічним методом, коли цитологічні дані вдається пов'язати з фенотипічним проявом ознаки.

Метод гібридизації соматичних клітин

Ефективним методом у дослідженнях генетики людини є гібридизація соматичних клітин. Оскільки соматичні клітини містять весь обсяг спадкової інформації, цей метод дає змогу вивчати на них генетичні закономірності всього організму. Для дослідження використовують клітини сполучної тканини (фібробласти) або лімфоцити крові. Гібридизацію культивованих разом соматичних клітин різних організмів здійснюють за допомогою вірусу парагрипу. Гібридизація можлива між клітинами не тільки організмів різних видів (людина — миша), а й різних типів (людина — комар). Гібридна клітина містить усі хромосоми обох батьківських клітин. Наприклад, гібридні клітини людини і миші мають 43 пари хромосом: 23 — від людини та 20 — від миші. Надалі поступово видаляють хромосоми того організму, клітини якого мають повільніший темп розмноження. У гібридних клітин "людина — миша" видаляють хромосоми людини.

У гібридних клітинах функціонують хромосоми як людини, так і миші, гени яких детермінують (визначають) синтез відповідних ферментів. За умов диференціального фарбування морфологічно можна відрізнити кожну з хромосом. Якщо в гібридній клітині відсутня якась хромосома і не відбувається синтез певних ферментів, то можна припустити, що гени, які визначають синтез цих ферментів, локалізовані в ній. Отже, цей метод допомагає встановлювати групи зчеплення у людини, а також, враховуючи делеції та транслокації, з'ясовувати і послідовність розташування генів, тобто складати генетичні карти хромосом людини; вивчати генні мутації, мутагенну та канцерогенну активність хімічних речовин, у т. ч. новостворюваних ліків.

На основі досліджень гібридних соматичних клітин виявлено, що ген групи крові за системою ABO міститься в дев'ятій хромосомі, за системою MN — у другій, а за системою Rh — у першій.

Дослідження соматичних клітин людини з використанням спеціальних ДНК-маркерів дає змогу досить точно визначити локалізацію генів у хромосомах. У такий спосіб було встановлено, що ген захворювання шкіри гіперкератозу (надмірного зроговіння епідермісу шкіри) міститься у 17-й хромосомі, а ген хвороби Альцгеймера (стареча недоумкуватість) — у 21-й. Успішно вивчають генетичну картину таких захворювань, як цукровий діабет, шизофренія та ін.

.

ПОПУЛЯЦІЙНИЙ МЕТОД

Дослідженнями спадкової структури населення займається демографічна статистика, даними якої користуються генетики для визначення частоти окремих генів або хромосомних аномалій у людських популяціях.

Популяційний метод дає змогу аналізувати поширення спадкових хвороб людини та прогнозувати їх частоту в наступних поколіннях, оцінювати наслідки споріднених шлюбів, визначати вплив генетичних і середовищних чинників на фенотипічну мінливість людини за певними ознаками, а також окреслювати генетичну історію окремої людської популяції.

Популяційний метод — сукупність математичних засобів для визначення частоти генів у популяціях людини та прогнозування динаміки ознак, які контролюються цими генами, у наступних поколіннях.

Для приблизного визначення співвідношення кількості різних генотипів та фенотипів у популяції користуються формулою Харді — Вайнберга.

У популяціях різні аномалії поширені з різною частотою, а рецесивні алелі перебувають переважно в гетерозиготному стані. Наприклад, приблизно кожний сімдесятий мешканець Європи гетерозиготний за геном альбінізму, а виявляється ця ознака лише з частотою 1 : 20 000. Дальтоніки трапляються з частотою 1 : 156, а гетерозиготний стан алеля дальтонізму наявний у кожного сьомого європейця.

Шкідливі наслідки споріднених шлюбів особливо наочно виявляються в ізолятах — групах особин популяції, які одружуються переважно з особинами своєї групи і тому характеризуються значною генетичною спорідненістю. Такі ізоляти можуть існувати на невеликих океанських островах, у віддалених поодиноких селищах, замкнутих етнічних громадах тощо. У межах ізоляту дуже часто подружжя несе однакові мутантні гени, наслідком чого є збільшення вірогідності вияву рецесивних алелей у гомозиготному стані. Наприклад, на Маріанських островах та острові Гуам (Океанія) смертність серед місцевого населення від бічного склерозу спинного мозку більше ніж у 100 разів перевищує смертність від цієї хвороби в інших країнах, У Південній Панамі значну частину корінного населення становлять альбіноси, які з'являються у кожному поколінні.

Популяційний метод допомагає зрозуміти динаміку генетичної структури різних популяцій та сприяє виявленню зв'язків між ними. Популяції можуть істотно різнитися за генетичним наповненням, наприклад за генами груп крові. Вдається також виявити деякі цілком чіткі закономірності. Так, в Індії та Китаї концентрація алеля Ів найбільша, а на схід та захід від цих країн спостерігається поступове зниження її аж до повного зникнення цього гена серед корінних мешканців Америки, Австралії та Полінезії. Одночасно у них максимуму досягає концентрація алеля 1°. Алель Iа у корінного населення Америки, Індії, Аравії, Тропічної Африки та Західної Європи трапляється надзвичайно рідко.

БІОХІМІЧНІ МЕТОДИ

Причиною численних спадкових порушень обміну речовин є різноманітні дефекти ферментів, які виникають унаслідок мутацій відповідних генів. Такі захворювання називають ферментопатіями (ензимопатіями). Найпоширенішими е фенілкетонурія, алкаптонурія, галактоземія, муковісцидоз, хвороба Гоше, хвороба Тея — Сакса, альбінізм та ін. Біохімічні показники (первинний продукт гена, накопичення патологічних метаболітів в організмі хворого) чіткіше відображають сутність хвороби порівняно з клінічними показниками.

Використання хроматографії, електрофорезу, спектроскопії тощо дає змогу визначити будь-які метаболіти, специфічні для конкретної спадкової хвороби.

Хроматографія — це спосіб розділення різних сумішей на складові. Метод полягає в тому, що в нерухомому середовищі, через яке протікає розчинник, кожний компонент, захоплений ним, рухається із певною швидкістю, незалежною від швидкостей інших компонентів. Якщо, наприклад, суміш пігментів, які визначають зелений колір рослини, розчинити в певному розчиннику і пропустити через нерухоме середовище, наприклад через мелену крейду, то вона розділиться на кілька різних пігментів. За таким самим принципом визначають наявність певного ферменту в складній суміші різноманітних речовин організму.

Електрофорез — це модифікація хроматографії, що дає змогу розділити молекули з різними зарядами. У хроматографічному середовищі під дією електричного поля різні молекули суміші рухаються в той чи інший бік залежно від їх відносних мас та зарядів. Електрофорез широко застосовують для виокремлення та ідентифікації амінокислот.

Спектроскопія полягає у визначенні будови молекул різноманітних речовин за допомогою спеціальних приладів — спектроскопів. Залежно від типу приладу спектроскопію здійснюють в ультрафіолетовій, видимій або інфрачервоній частинах спектра. Світло пропускають через досліджувану речовину і аналізують його спектр на виході. Кожний хімічний елемент має характерні лінії у спектрі, тому можна визначити хімічну структуру молекули досліджуваної речовини. У такий спосіб ідентифікують певний фермент чи іншу хімічну сполуку в організмі або визначають будову раніше не відомої речовини.

Об'єктами біохімічних аналізів можуть бути сеча, піт, плазма та клітини крові, культури клітин (фібробласти, лімфоцити).

Біохімічні методи — визначення наявності певних речовин (переважно первинних продуктів генів — ферментів та патологічних метаболітів з метою діагностування спадкових хвороб).

Біохімічні методи дуже трудомісткі, потребують спеціального обладнання, тому їх не можна використовувати для масових популяційних досліджень з метою раннього виявлення хворих із спадковою патологією обміну. Останнім часом у різних країнах розробляють і використовують для масових досліджень спеціальні програми. Перший етап такої програми називають скринінгом (англ. screening — просіювання), що полягає у виокремленні серед великої кількості обстежуваних імовірно хворих, які мають певні спадкові відхилення від норми. На цьому етапі звичайно застосовують прості та доступні експрес-методи для виявлення продуктів обміну у сечі, крові. На другому етапі проводять уточнення (підтвердження чи спростування діагнозу) з використанням точних хроматографічних методів визн. ачення ферментів, амінокислот тощо.

Використовують також мікробіологічні тести, які ґрунтуються на тому, що деякі штами бактерій ростуть тільки в середовищах, котрі містять певні амінокислоти, вуглеводи. Якщо у крові або сечі є необхідна для росту речовина, то у чашці Петрі навколо фільтрувального паперу, просоченого однією з цих рідин, спостерігається активне розмноження бактерій, чого не відбувається у разі тестування крові або сечі здорової людини.

Біохімічні методи застосовують також і для виявлення гетерозиготних носіїв спадкових аномалій, які у фенотипі проявляються невиразно. Це роблять за допомогою біохімічного тестування, мікроскопічного дослідження клітин крові та тканин, визначення активності певного ферменту, зміненого внаслідок мутації тощо. Такі заходи необхідні для своєчасного лікування та профілактики, а також визначення вірогідності народження хворої дитини в генетично ризиковій сім'ї.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНИЙ МЕТОД

Аналізувати фрагменти ДНК, знаходити та ізолювати окремі гени і їх сегменти та визначати в них послідовність нуклеотидів дає змогу молекулярно-генетичний метод.

Молекулярно-генетичний метод — використання біохімічних реакцій, які здійснюються за допомогою відповідних ферментів, з метою визначення структури генів, їх ідентифікації та локалізації, а також характеру мутацій.

Цей метод успішно застосовують для ідентифікації генних мутацій, а також вивчення геному людини. Поширився він у 70—80-ті роки XX ст. у зв'язку з розвитком молекулярної генетики.

Початковим етапом молекулярно-генетичного аналізу є одержання достатньої кількості зразків ДНК через клонування. Для цього використовують геномну ДНК — усю ДНК клітини або окремі її фрагменти.

Деспіралізацію, виявлення та вирізання відповідних фрагментів ДНК здійснюють за допомогою особливих ферментів — ресшриктаз. Різні рестриктази розпізнають тільки відповідні послідовності нуклеотидів та розрізають ДНК у визначених місцях. Виокремлені фрагменти ДНК за допомогою спеціальних ферментів — полімераз — копіюють у необхідній кількості.

Копійовані фрагменти ДНК за допомогою електрофорезу на агаровому або поліакридамідному гелі розділяють на фракції за розмірами. Під дією електричного поля фрагменти ДНК рухаються у гелі зі швидкістю, залежною від їх довжини: чим вони коротші, тим швидше рухаються. У результаті цього фрагменти ДНК через деякий час займають певне місце на полосі гелю у вигляді окремих смуг. Довжину кожного фрагмента визначають шляхом порівняння відстаней, пройдених ним, і стандартним відрізком ДНК (із відомими розмірами та послідовністю основ).

Для ідентифікації виокремлених фрагментів ДНК їх спочатку розділяють на два ланцюжки, а потім гібридизують із відповідними маркерними фрагментами ДНК. Якщо при цьому утворюється нормальна подвійна спіраль, то досліджуваний фрагмент не мав порушень. Якщо спіраль має дефекти, то досліджуваний фрагмент є мутантним.

Різні модифікації цього методу дають змогу проаналізувати в лабораторії навіть незначну кількість ДНК, узяту у хворого. їх використовують для пренатальної діагностики спадкових хвороб. При цьому ДНК отримують з ембріональних клітин, які містяться у навколоплідній рідині. Аномальний ембріон легко розпізнати, бо його ДНК гібридизується тільки з маркерним фрагментом ДНК, який має комплементарну мутантну послідовність нуклеотидів.

У 90-ті роки XX ст. за допомогою молекулярно-генетичної методики були ідентифіковані та локалізовані гени, відповідальні за такі важкі спадкові хвороби нервової системи людини, як хорея Гентингтона, міотонічна дистрофія, синдром ламкої Х-хромосоми та ін. Наприклад, ген хореї Гентингтона локалізований у короткому плечі 4-ї хромосоми. Він має ділянку, де нуклеотидна послідовність представлена багаторазовим повторенням трьох основ ЦАГ (цитозин — аденін — гуанін). У нормі кількість таких повторів коливається від 11 до 34, а у хворих унаслідок мутації гена їх 37—86. Хвороба успадковується за аутосомно-домінантним типом, а ознака проявляється в усіх носіїв гена.

На основі молекулярно-генетичного методу нині успішно розробляють технології генної терапії найпоширеніших спадкових хвороб, наприклад муковісцидозу.

Після повторення теоретичного матеріала з метою контроляюзнань пройдіть тест з 20 питань. Тест можна проходити декилько разів до отримання позитивного результату ( посилання на тест знаходиться в чаті заняття).